Priručnik za protočnu citometriju
Protočna citometrija je moćna, laserska metoda za analizu fizičkih i kemijskih karakteristika pojedinih stanica u populaciji mješovitih stanica. Naš jednostavan digitalni priručnik osmišljen je kao referenca za svakog korisnika protočne citometrije. Znanstvenici koji koriste tradicionalne citomemetre naučit će kako rutinski tijekovi rada mogu imati koristi od brzine, propusnosti i vrhunskog multipleksiranja koje nudi iQue® Advanced Flow Cytometry Platform.
Naši intuitivni protočni citometri mogu vas odvesti od uzorka do biološki relevantnih podataka brže od bilo kojeg instrumenta na tržištu. Elegantan i jednostavan program omogućuje vam da shvatite složene skupove podataka i ubrzate svoje istraživanje.
Bilo da otkrivate novo terapijsko protutijelo, razvijate specifičan inhibitor kontrolne točke ili procjenjujete funkciju CAR-T stanica, napredovanje vašeg istraživanja ovisi o sposobnosti brze procjene većeg broja uzoraka na biološki relevantan, ponovljiv i isplativ način.
Odabir odgovarajućih fluorokroma za multipleksiranje markera fenotipa i funkcije stanice u jednoj jažici, ključan je za rješavanje složenih pitanja staničnih istraživanja kako bi se učinkovito karakteriziralo stanje bolesti.
Preuzmite brošuru o iQue® 3 i iQue® Screener Plus Fluorochrome
Često postavljana pitanja o protočnoj citometriji
Protočna citometrija analizira fizičke karakteristike suspenzijskih stanica i čestica, koristeći informacije o njihovoj veličini, složenosti (koja se naziva i granularnost) i relativnom intenzitetu flourescencije.
Sustav fluida protočnog citometra prenosi struju tekućine do laserske zrake. Stanice ili čestice prolaze kroz laser jedna po jedna, u jednoj datoteci. U komponenti optičkog sustava protočnog citometra, laserska zraka osvjetljava stanice/čestice i usmjerava raspršeno svjetlo i flourescenciju na odgovarajuće detektore.
Elektronički sustav protočnog citometra pretvara te svjetlosne signale u elektroničke signale koje vaše računalo može obraditi. Tipični protočni citometar može se postaviti za prikupljanje određenog broja događaja po uzorku.
Svaka suspendirana čestica ili stanica veličine od 0,2 do 150 mikrometara prikladna je za analizu. Stanice iz čvrstog tkiva moraju se desegregirati prije analize.
Kako bi se prikupile dodatne informacije, stanice se mogu označiti fluorescentnim molekulama. Točnije, antitijela obilježena fluorokromom mogu se vezati za proteine na površini stanice (antigene). Ako stanica ima mnogo antigena, veliki broj antitijela obilježenih fluorokromom će se vezati na nju stvarajući snažan fluorescentni signal. Stanica bez ili s malo antigena proizvest će slabiji fluorescentni signal.
Fluorescentni marker, kao što je antitijelo konjugirano s fluoroforom, izravno cilja na epitop od interesa i omogućuje mjerenje njegovih bioloških i biokemijskih svojstava. Fluorescentni markeri korisni su u širokom rasponu primjena, uključujući identificiranje i kvantificiranje različitih populacija stanica, staničnih površinskih receptora ili unutarstaničnih ciljeva, razvrstavanje stanica, imunofenotipizaciju i studije apoptoze.
U eksperimentu protočne citometrije, svaka stanica koja prođe kroz točku ispitivanja i bude otkrivena računat će se kao poseban događaj. Svaka vrsta svjetlosti koja se detektira (raspršeno prema naprijed, bočno raspršeno i svaka različita valna duljina fluorescentne emisije) također će imati svoj jedinstveni kanal.
Podaci za svaki događaj iscrtavaju se neovisno, kako bi predstavili intenzitet signala svjetlosti detektiran u svakom kanalu za svaki događaj. Ti se podaci mogu vizualno prikazati na više različitih načina. Najčešći tipovi podatkovnih grafikona koji se koriste u protočnoj citometriji uključuju histograme, točkaste dijagrame i konturne dijagrame.
Histogrami
Histogram se obično koristi za usporedbu intenziteta fluorescencije dviju ili više populacija.
Dot Plots
Točkasti dijagrami uspoređuju 2 ili 3 parametra istovremeno na dijagramu raspršenosti gdje je svaki događaj predstavljen kao jedna točka (ili točka). Točkasti grafikon je slika koja prikazuje odnos između više varijabli odjednom, a parametri mogu biti bilo koja kombinacija raspršenih i fluorescentnih signala.
Konturne plohe
Konturni dijagrami prikazuju relativnu učestalost populacija, bez obzira na broj prikupljenih događaja. Konturni dijagram prikazuje konturiranje vjerojatnosti sa spojenim linijama koje predstavljaju sličan broj ćelija. Koncentrični prstenovi formiraju se oko populacija tako da što je veća gustoća, to su prstenovi bliže konturnom dijagramu.
Slika 1. Primjeri podataka protočne citometrije. (A) Raji stanice (jarko obilježene bojom iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye), Ramos stanice (blago obilježene bojom za kodiranje) i Jurkat stanice (neoznačene) kombinirane su (5K/jažici) za CDC test i odvojeni na temelju njihove fluorescencije boje kodera, kao što je prikazano na histogramu. (B) Primjer točkastog dijagrama unaprijed definiranih vrata na iQue Forecyt® omogućuje automatsko fenotipiziranje podskupa ljudskih T stanica. (C) Konturni prikaz s jasnim usmjeravanjem CD14 pozitivne populacije.
Protočna citometrija moćan je alat koji ima primjenu u imunologiji, molekularnoj biologiji, bakteriologiji, virologiji, biologiji raka i praćenju zaraznih bolesti. Najčešća primjena u protočnoj citometriji je imunofenotipizacija. Koristi jedinstvenu sposobnost protočne citometrije za simultanu analizu miješanih populacija stanica za više parametara kao što su površinski markeri, analiza citokina i zdravlje stanica.
