Nova uredba EP 2.6.7: Kaj se spreminja pri odkrivanju mikoplazem in kako ostati skladen?

Zakaj je odkrivanje mikoplazem tako pomembno?

Mikoplazme so eni najnevarnejših in najtežje zaznavnih kontaminantov v bioprocesni proizvodnji. Za razliko od bakterij in gliv se ne zaznajo s standardnimi testi sterilnosti — ne rastejo na običajnih gojiščih in ne povzročajo vidne motnosti.

Posledice kontaminacije z mikoplazmami so resne:

• neposreden vpliv na kakovost biofarmacevtskih izdelkov
• tveganje za varnost bolnikov
• stroški umika serij in ponovne validacije.

Prav zato obstaja EP 2.6.7 — kot harmonizirani regulatorni okvir, ki zagotavlja doslednost in zaupanje v testiranje mikoplazem po vsej industriji.

Kaj prinaša nova EP 2.6.7 (12.2.)?

Metode NAT postanejo enakovredne kultivaciji

Najpomembnejši premik v revidirani EP 2.6.7 je formalno priznanje tehnik amplifikacije nukleinskih kislin (NAT) — vključno s metodami PCR — kot enakovrednih tradicionalni kultivaciji indikatorskih celic.

Do zdaj so bili hitri mikrobiološki testi na osnovi PCR dovoljeni kot alternativa, vendar brez jasno opredeljenih meril za dokazovanje enakovrednosti. Nova uredba to spreminja:

• metode NAT dobijo lasten regulatorni okvir znotraj poglavja
• opredeljeni so eksplicitni kriteriji učinkovitosti za primernostne študije
• poudarjene so prednosti: krajši čas analize in zmožnost zaznavanja tako kultivabilnih kot nekultivabilnih mikoplazem.

Ta razvoj je usklajen s sočasnim napredkom v ZDA — USP trenutno razvija osnutek poglavja USP <77>: Mycoplasma Nucleic Acid Amplification Tests.

Nova meja zaznave: enote CFU in GC

Osrednja tehnična zahteva revizije se nanaša na mejo zaznave (LOD). Metoda PCR, namenjena nadomestitvi kultivacije, mora izkazati:

≤ 10 CFU/mL ali < 100 genomskih kopij (GC)/mL. 

Zakaj se uvaja enota GC?

En mikroorganizem lahko vsebuje več kopij genoma. Klasična enota CFU (colony-forming units) opisuje število živih, kultivabilnih organizmov — PCR pa zaznava nukleinske kisline ne glede na kultivabilnost. Z uvedbo enote GC dobimo standardiziran referenčni okvir, ki omogoča smiselno primerjavo med metodami NAT in kultivacijskimi metodami.

Poleg tega nova uredba določa:

Razmerje GC:CFU mora biti manjše od 10 za referenčne preparate.

To je ključni parameter, ki ga mora vaša ekipa upoštevati pri izbiri in validaciji referenčnih standardov.

Razširjena plošča referenčnih vrst

Validacijska plošča mora zdaj odražati vrste mikoplazem, ki so realno povezane z biološkim izvorom surovin in vašega proizvodnega sistema.

Večji poudarek na kontroli procesov

Revizija uvaja jasnejše zahteve za nadzor celotnega analitičnega toka:

1. Zunanji kontrolni vzorci se dodajo pred ekstrakcijo nukleinskih kislin (kadar koli je mogoče) — za spremljanje ekstrakcije, amplifikacije in morebitne inhibicije.
2. Testirati je treba tako celično frakcijo kot supernatant — mikoplazme se lahko vežejo na celice, kar pomeni, da testiranje samo supernatanta morda ni zadostno.
3. Zahteva se formalna ocena specifičnosti metode glede na filogenetsko sorodne, a ne-mikoplazemske bakterije.

Vse validacije, izvedene v skladu z EP 2.6.7 (01/2008), ostanejo veljavne — pod pogojem, da so bile odobrene pred 1. aprilom 2026.

Za vse nove validacije in revalidacije veljajo zahteve nove EP 2.6.7 (12.2.). Naša ekipa nudi celovito podporo prek validacijskih storitev za biofarmacevtsko industrijo.

Uporabljate standarde Microsart®?

Test Microsart® AMP za odkrivanje mikoplazem je bil v celoti skladen z EP 2.6.7 (01/2008). Vendar pa navzkrižna validacija z novo metodo kvantifikacije dPCR kaže višje vrednosti GC — kar pomeni, da standardi Microsart® 10 CFU ne izpolnjujejo več zahtev revidirane EP 2.6.7 (12.2.).

Kompleti Microsart® ostajajo na voljo za laboratorije, ki še naprej delujejo po starih standardih. Za vse prihodnje validacije po novi uredbi pa priporočamo prehod na generacijo Cyclus®.

Cyclus® — portfelj, zasnovan za novo EP 2.6.7

Sartorius je razvil Cyclus® kot neposreden odgovor na posodobljene regulatorne zahteve. Vsak element portfelja ciljno naslavlja eno ali več novih zahtev.

Cyclus® Bead Extraction

Izolacija nukleinskih kislin z magnetnimi nosilci namesto klasičnih silika spin kolon. Združljivo z ročnimi in avtomatiziranimi protokoli (KingFisher™ Flex), prilagojeno za visoko-zmogljive aplikacije brez kompromisov pri natančnosti.

Več informacij o novem portfelju izdelkov Cyclus® bo objavljenih kmalu.

Checklist: 5 korakov za skladnost z novo EP 2.6.7

1. Preglejte datume validacij — so bile izvedene pred ali po 1. aprilu 2026?
2. Ocenite referenčno ploščo — vključuje vse vrste, relevantne za vaš sistem, vključno z M. salivarium?
3. Preverite razmerje GC:CFU vaših referenčnih standardov — mora biti manjše od 10.
4. Uvedite zunanje kontrole pred ekstrakcijo v rutinske protokole.
5. Načrtujte prehod na standarde Cyclus® za vse validacije po novih zahtevah.

Revizija EP 2.6.7 formalno potrjuje, kar industrija že ve: molekularne metode so prihodnost testiranja mikoplazem. Za laboratorije v farmacevtski in biotehnološki industriji to ni le vprašanje skladnosti z uredbo — to je priložnost za posodobitev delovnih tokov in krepitev zaupanja v procese QC.

Imate vprašanja o prehodu? Stopite v stik z nami prek kontaktnega obrazca ali nam pišite na sartorius@sartorius.hr.