Priročnik za napredno pretočno citometrijo
Pretočna citometrija je zmogljiva laserska metoda za analizo fizikalnih in kemičnih značilnosti posameznih celic v mešani celični populaciji. Naš preprost digitalni priročnik je zasnovan kot referenca za vsakega uporabnika pretočne citometrije. Znanstveniki, ki uporabljajo tradicionalne citometre, se bodo naučili, kako lahko rutinski delovni tokovi izkoristijo hitrost, prepustnost in vrhunsko multipleksiranje, ki jih ponuja napredna platforma za pretočno citometrijo iQue®.
Naši intuitivni pretočni citometri vas lahko popeljejo od vzorca do biološko pomembnih podatkov hitreje kot kateri koli instrument na trgu. Eleganten in preprost program vam omogoča, da razumete kompleksne nize podatkov in pospešite svoje raziskave.
Ne glede na to, ali odkrivate novo terapevtsko protitelo, razvijate specifičen inhibitor kontrolne točke ali ocenjujete delovanje celic CAR-T, je napredek vaših raziskav odvisen od zmožnosti hitrega ocenjevanja velikega števila vzorcev na biološko pomemben, ponovljiv in stroškovno učinkovit način.
Izbira ustreznih fluorokromov za multipleksiranje markerjev celičnega fenotipa in delovanja v eni vdolbinici je ključnega pomena za reševanje kompleksnih celičnih raziskovalnih vprašanj za učinkovito karakterizacijo bolezenskih stanj.
Prenesite brošuro iQue® 3 in iQue® Screener Plus Fluorochrome
Pogosta vprašanja o pretočni citometriji
Pretočna citometrija analizira fizikalne značilnosti suspenzijskih celic in delcev z uporabo informacij o njihovi velikosti, kompleksnosti (imenovani tudi granularnost) in relativni intenzivnosti fluorescence.
Tekočinski sistem pretočnega citometra prenaša tok tekočine do laserskega žarka. Celice ali delci gredo skozi laser ena za drugo v eni datoteki. V komponenti optičnega sistema pretočnega citometra laserski žarek osvetljuje celice/delce ter usmerja razpršeno svetlobo in fluorescenco na ustrezne detektorje.
Elektronski sistem pretočnega citometra pretvori te svetlobne signale v elektronske signale, ki jih lahko obdela vaš računalnik. Tipičen pretočni citometer je mogoče nastaviti za zbiranje določenega števila dogodkov na vzorec.
Za analizo je primeren vsak suspendiran delec ali celica velikosti od 0,2 do 150 mikrometrov. Celice iz trdnega tkiva je treba pred analizo razčleniti.
Za zbiranje dodatnih informacij lahko celice označimo s fluorescenčnimi molekulami. Natančneje, s fluorokromom označena protitelesa se lahko vežejo na celične površinske beljakovine (antigene). Če ima celica veliko antigenov, se bo nanjo vezalo veliko število s fluorokromom označenih protiteles, kar bo povzročilo močan fluorescenčni signal. Celica brez ali z malo antigena bo proizvedla šibkejši fluorescentni signal.
Fluorescentni marker, kot je protitelo, konjugirano s fluoroforjem, neposredno cilja na epitop, ki nas zanima, in omogoča merjenje njegovih bioloških in biokemičnih lastnosti. Fluorescentni markerji so uporabni v številnih aplikacijah, vključno z identifikacijo in kvantifikacijo različnih celičnih populacij, celičnih površinskih receptorjev ali znotrajceličnih tarč, razvrščanjem celic, imunofenotipizacijo in študijami apoptoze.
V poskusu s pretočno citometrijo se bo vsaka celica, ki gre skozi testno točko in je zaznana, štela kot ločen dogodek. Vsaka vrsta zaznane svetlobe (razpršeno svetlobo naprej, stransko sipanje in vsaka različna valovna dolžina fluorescenčne emisije) bo imela tudi svoj edinstveni kanal.
Podatki za vsak dogodek so narisani neodvisno, da predstavljajo intenzivnost svetlobnega signala, zaznanega v vsakem kanalu za vsak dogodek. Te podatke je mogoče vizualno prikazati na več različnih načinov. Najpogostejše vrste podatkovnih grafov, ki se uporabljajo v pretočni citometriji, vključujejo histograme, pikčaste grafike in konturne grafike.
Histogrami
Histogram se običajno uporablja za primerjavo intenzivnosti fluorescence dveh ali več populacij.
Dot Plots
Raztreseni grafikoni primerjajo 2 ali 3 parametre hkrati na razpršenem grafikonu, kjer je vsak dogodek predstavljen kot ena pika (ali točka). Točkovni grafikon je slika, ki prikazuje razmerje med več spremenljivkami hkrati, parametri pa so lahko poljubna kombinacija razpršenih in fluorescenčnih signalov.
Konturne površine
Konturne ploskve prikazujejo relativno pogostost populacij, ne glede na število zbranih dogodkov. Konturni prikaz prikazuje konturo verjetnosti s povezanimi črtami, ki predstavljajo podobno število celic. Okoli populacij se oblikujejo koncentrični obroči, tako da večja kot je gostota, bližje so obroči konturni ploskvi.
Slika 1. Primeri podatkov pretočne citometrije. (A) Raji celice (svetlo označene z barvilom iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye), celice Ramos (lahko označene s kodirnim barvilom) in celice Jurkat (neoznačene) so bile združene (5K/jamico) za test CDC in ločeni na podlagi njihove barvne fluorescence koderja, kot je prikazano v histogramu. (B) Primer pikčastega grafa vnaprej določenih vrat na iQue Forecyt®, ki omogoča samodejno fenotipizacijo podskupin človeških celic T. (C) Konturni pogled z jasno orientacijo CD14 pozitivne populacije.
Pretočna citometrija je močno orodje, ki se uporablja v imunologiji, molekularni biologiji, bakteriologiji, virologiji, biologiji raka in spremljanju nalezljivih bolezni. Najpogostejša uporaba pretočne citometrije je imunofenotipizacija. Uporablja edinstveno zmogljivost pretočne citometrije za istočasno analizo mešanih celičnih populacij za več parametrov, kot so površinski markerji, analiza citokinov in zdravje celic.
